细胞培养过程中，有多虐心就有多少需要注意的地方。作为生物学研究最基础的技术之一，细胞培养可以说渗透生命科学研究的方方面面。下面就将胎牛血清的作用、选择及保存、冻融方法介绍给大家。

　　血清及其作用

　　血清，在血浆中除去纤维蛋白分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋白已被除去的血浆。其主要作用：一、血清提供：营养和能量来源;生长和粘附因子;肽和类固醇激素;载体蛋白;二、保护细胞：免受蛋白酶、毒性物质、PH值波动、机械剪切力、氧化及自由基的损伤。

　　胎牛血清特点

　　采集方法：通过密闭系统收集法保证血清质量，保证低内毒素、低血红蛋白

　　过滤方法：通常采用3个连续的100nm孔径的过滤器过滤

　　检测体系：每批产品均经过严格的细菌、支原体、病毒、内毒素、血红蛋白等检测

　　胎牛血清与新生牛血清、小牛血清区别

　　1.血清类别

　　血清类别

　　胎龄

　　胎牛血清(FBS)

　　胎儿(母牛怀孕3-8个月)

　　新生牛血清(NCS)

　　出生10日内

　　小牛血清(BCS)

　　16-22周

　　供体血清

　　成年牛

　　2.采血方式不同

　　胎牛血清：母牛怀孕3-8个月时，采用剖腹心脏密闭穿刺取血

　　新生牛血清、小牛血清、供体牛血清：分别是取自新生牛(小牛)、成牛的血

　　3.血清成份不同

　　胎牛血清还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少;促细胞生长因子、促帖附因子、激素及其他活性物质等组分也不同于其他几类血清。

　　4.用途不同

　　某些细胞的培养必须使用胎牛血清才行，如：干细胞、淋巴细胞、神经细胞、星状胶质细胞等;而有些细胞需要小牛血清就可以，如：肿瘤细胞等。使用浓度也不同，一般在10%-15%，有特殊要求的浓度在20%。

　　5.颜色不同

　　血清根据血红蛋白含量的不同，表现的颜色也不一样

　　真正的胎牛血清凝血功能差，红细胞容易破裂，一般表现出微红色或橘红色;而新生牛(小牛)血清则表现为蜡黄色或偏黄色。

　　6.澄清度和粘稠度不同

　　胎牛血清蛋白和脂类含量低，表现为稀薄、清淡;

　　新生牛(小牛)血清相比更加粘稠

　　7.血清选择

　　在这几类血清中，胎牛血清的品质无疑是最高的，如果你的细胞比较娇贵难养，出现比较好的培养效果请选择胎牛血清;如果你的细胞比较易养，给点什么血清都能出现很好的效果，使用新生牛(小牛)血清就足够了。

　　一般选择血清种类可以根据ATCC及实验需要来选择

　　血清保存

　　1.如何保存血清?

　　血清应该在-20℃保存。如果一次无法用完一瓶，应该无菌分装后冷冻保存。注意避免反复冻融。

　　2.为什么储存在冰箱中的血清会出现沉淀?

　　有些胎牛血清产品没有预老化，储存在2-8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在-20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。

　　血清正确解冻方法

　　将血清首先置于冰箱2-8℃中12-24小时，使之缓慢部分溶解，然后再放在室温下使之全溶。注意：溶解过程中要每隔一段时间缓慢地摇动血清使之混匀。切记：避免37℃水浴。

　　常见问题及解决方案

　　1.血清中的沉淀物是什么?

　　纤维蛋白：是常出现的较大沉淀物。因为血清都是在低温下进行收集和快速处理的，一些纤维蛋白原在处理过程中仍处于溶解状态，在最后的过滤后发生凝结，形成纤维蛋白沉淀。

　　磷酸钙：是一种常见的沉淀物。通常会使血清浑浊，并且在37℃培养时会增加。这种沉淀物在倒置显微镜下观察像小黑点，这些小黑点由于布朗运动，看上去可以活动，因此经常被误认为是微生物污染。

　　其它：一些脂类或蛋白质。

　　2.严重的沉淀一般为操作不当引起

　　解冻程序不合理;

　　储存不当：多次反复冻融或长期储存在2-8℃，或在室温下放置时间过长。

　　3.哪些处理会使血清沉淀增加?

　　伽马γ射线辐照

　　37℃培养血清

　　热灭活血清

　　不正确的解冻操作，融化时没有混匀

　　储存不当：反复冻融;长期2-8℃储存或室温下放置时间过长。

　　4.如何避免血清中产生沉淀

　　按如下操作可避免沉淀的产生：

　　(1)解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。

　　(2) 血清分装冻存时，须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一。

　　(3) 勿直接由-20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。

　　(4) 勿将血清置于37℃太久，否则血清会变得浑浊，同时血清中许多较不稳定的成份也会因此受到破坏，从而影响血清的品质。

　　(5) 血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。

　　(6) 若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。

　　5.血清解冻后发现有絮状沉淀物，该如何处理?

　　血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。

　　若您欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，取上清液即可加入培养基中进行细胞培养，不影响培养过程。

　　我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞过滤膜。

　　6.可否使用与原先培养条件不同的血清种类?

　　不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。所以不能直接更换正在培养细胞所用的血清，即使是同种血清不同的批次。

　　对于混用血清，原则上是要以原有血清为主，逐渐增加新血清的比例，最终将原有血清替换掉。比例一般采用的是3:1-1:1-1:3-100%新血清。

　　7.何谓热灭活?

　　一般是以56℃，30分钟来处理已解冻的血清，因为此加热步骤，可以使补体去活化，而补体所参与的反应有:溶细胞活性，平滑肌的收缩，肥大细胞和血小板组胺的释放，增强吞噬作用，淋巴细胞、巨噬细胞的趋化和激活。

　　8.为什么要热灭活血清?

　　加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养ES细胞、昆虫细胞、平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。

　　9.有必要热灭活吗?

　　实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒立显微镜下观察，像是 “小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。

　　因此我们建议您，若非必须，您可以不需要做热处理这一步。如此一来，不但节省您宝贵的时间，更确保您血清的质量!

　　10.热灭活的正确方法

　　将融化的血清和盛有相同体积的水的烧杯同时放在56°C中水浴，当烧杯中的温度计及指示达到56℃时开始计时，30min后灭活结束，整个过程中需要随时摇晃混匀 。